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母乳是嬰兒成長(zhǎng)過(guò)程中重要的食品，國(guó)內(nèi)外的孕嬰保健機(jī)構(gòu)都建議初生嬰兒采用母乳喂養(yǎng)。母乳中含有的營(yíng)養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等，易于嬰兒吸收。另外其所含有的抗感染因子，如IgA、乳鐵蛋白、溶菌酶及各種細(xì)胞成分，可增強(qiáng)嬰兒的免疫能力。因此，母乳中營(yíng)養(yǎng)成分研究也成為營(yíng)養(yǎng)學(xué)的一大領(lǐng)域。目前，已有對(duì)母乳中的維生素進(jìn)行研究并加以報(bào)道，但少有氨基酸的研究報(bào)道。本研究采用酸性條件下水解母乳中蛋白質(zhì)，柱前在線衍生與液相色譜紫外聯(lián)用分析母乳中氨基酸。

樣品前處理

17種氨基酸混標(biāo)溶液（除胱氨酸濃度為1.25μmol/ml，其它氨基酸濃度為2.5μmol/ml）

7M鹽酸：量取558ml鹽酸，用水稀釋至1000ml量瓶中，搖勻。

樣品由第三方醫(yī)療機(jī)構(gòu)收集不同哺乳期婦女的乳液樣品。樣品呈乳白色懸濁液（含有少量黃色液體油脂。低溫保存時(shí)，樣品取出后放置在40°C水浴中使固體油脂融化）。

水解：吸取1ml脫脂后的母乳樣品轉(zhuǎn)移至真空水解管中，加入0.6ml水解催化劑，在0.05MPa壓力下充氮保護(hù)3分鐘，再減壓脫氣3分鐘，密塞水解管并置于沸水浴上恒溫加熱8小時(shí)，冷卻至室溫，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值2-3范圍內(nèi)，用0.1N鹽酸溶液稀釋并定容至10ml，搖勻并用微孔（0.22μm）濾膜過(guò)濾用于液相分析。

衍生程序

采用鄰苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯在堿性條件下分別與一級(jí)氨基酸和二級(jí)氨基酸發(fā)生反應(yīng)，生成具有強(qiáng)烈紫外吸收的化合物。衍生過(guò)程在自動(dòng)進(jìn)樣器中進(jìn)行。

衍生試劑：

硼酸緩沖液： 200mM 四硼酸鈉溶液（pH=10.2）

鄰苯二甲醛溶液（OPA）：50mg/ml(甲醇)

OPA/MPA溶液：0.8ml 硼酸緩沖液-0.2ml OPA溶液-20μl 3-巰基丙酸

氯甲酸芴甲酯（FMOC）溶液：2.5mg/ml（乙腈）

稀釋液：流動(dòng)相A

衍生過(guò)程：200mM 硼酸緩沖液（5μL）+樣品（1μL）+OPA/MPA溶液（1μL）+FMOC溶液（1μL）+稀釋液（8μL）

儀器型號(hào)：

UltiMate3000:

LPG-3400，SN:8014896

WPS-3000TSL, SN:8014671

TCC-3000, SN:801179

DAD， SN:8037084

變色龍®色譜管理軟件（Chromeloeon®6.8 SR11）

色譜條件：

色譜柱 ： Hypersil GOLD C18色譜柱, 4.6×250mm, 5μm, PN:25005-254630

流動(dòng)相 ：A: 20mM 乙酸鈉（加0.018%三乙胺，調(diào)節(jié)pH值至7.2，再加入0.3%四氫呋喃），B：100mM乙酸鈉（pH=7.2）-乙腈-甲醇（20:40:40）

梯度洗脫程序

進(jìn)樣量： 1μL

檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)：380nm, 262nm, 3D掃描：190-400nm，采集頻率：5Hz

流速： 1000μL/min

柱溫：  35°C

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

01

水解條件優(yōu)化

在水解過(guò)程中，加熱溫度、水解持續(xù)時(shí)間和催化劑用量對(duì)水解有著重大影響。結(jié)合實(shí)際情況采用沸水浴加熱進(jìn)行水解，因此利用響應(yīng)面法對(duì)水解時(shí)間和催化劑用量的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果見表1和圖1。

表1 水解研究方案

圖1 氨基酸水解優(yōu)化結(jié)果

從圖1中可以看出，水解時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)氨基酸增加效果不明顯，水解催化劑用量對(duì)水解效率有顯著影響，隨著用量增大，氨基酸含量明顯增加，且達(dá)到大值，再增加用量時(shí)，氨基酸含量開始降低，可能原因是水解后的氨基酸在強(qiáng)酸性環(huán)境與高溫加熱條件下中發(fā)生降解從而引起含量降低。綜合實(shí)際操作考慮，故用0.6ml水解催化劑在沸水浴中水解8小時(shí)可獲得佳水解氨基酸含量。

02

 方法專屬性

取0.1N鹽酸做為空白試劑考察方法專屬性，結(jié)果見圖2和3。

03

線性范圍

取氨基酸混標(biāo)溶液用1%鹽酸（約0.1N）稀釋成濃度為0.025、0.05、0.125、0.25、0.50μmol/ml的溶液，按照前述條件測(cè)定其響應(yīng)值，并與濃度做線性回歸，結(jié)果見表4。

04

方法精密度

取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5針，結(jié)果見圖4。

05

方法度

按前述方法平行測(cè)定母乳樣品與加標(biāo)樣品，計(jì)算其含量與加標(biāo)回收率。結(jié)果見圖5與表5。

表5加標(biāo)回收率（樣品編號(hào)：12-8，n=2）

結(jié)論

通過(guò)上述方法學(xué)考察結(jié)果分析，本方法具有線性范圍寬、專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于母乳中測(cè)定氨基酸含量。